Il percorso del Museo si snoda attraverso cinque ampie sale dedicate ognuna ad un momento storico ed artistico diverso.
Nella prima si possono ammirare i dieci misteriosi “rilievi neri”, caratteristici per il loro primitivismo, che ricordano addirittura l’arte africana o le grandi sculture dell’isola di Pasqua. Si sa poco della loro origine e della loro funzione. Probabilmente facevano parte di un’antichissima chiesa massetana e furono poi collocati verso la metà dell’Ottocento nella controfacciata della Cattedrale di San Cerbone.

La seconda sala propone un interessante confronto tra la scultura lignea dipinta e la scultura su marmo della scuola gotica senese e pisana del periodo compreso tra fine del Duecento e l’inizio del Trecento. L’intera parete di fondo è occupata dalla ricostruzione in anastilosi della loggetta di coronamento della facciata della Cattedrale: in un contesto architettonico che permette di comprenderne provenienza e funzione, sono inserite tre sculture originali (Telamone, Grifo e Cavallo) di Giovanni Pisano. Nella stessa sala è possibile vedere a confronto il Crocifisso ligneo dipinto di Giovanni Pisano e l’importante Croce stauroteca di Andrea Pisano e soci, sbalzata in argento e decorata da figurazioni coperte di smalti traslucidi. Due lunghe mensole accolgono inoltre gli Apostoli, Profeti e Santi, opera dello scultore senese Gano di Fazio.

La terza sala è dedicata ai Lorenzetti, con la splendida tavola della Maestà di Ambrogio e la vetrata derivata da un cartone di Pietro, che decorava un occhio della sagrestia della Cattedrale.

In un’ampia sala al piano superiore si possono ammirare alcune pregevoli opere pittoriche di Sano di Pietro e di Stefano di Giovanni detto il Sassetta, oltre a due lastre tombali in marmo, una delle quali opera dello scultore Urbano da Cortona, allievo di Donatello, e ad altre opere quattrocentesche.

L’ultima sala infine è dedicata alle oreficerie e ai paramenti sacri.